抗日战争爆发后，1937年8月，张正坤回到浏阳，担任湘鄂赣人民抗日红军游击支队副司令员，率领游击队活动在平江、浏阳、铜鼓、万载一带，为宣传抗日救国十大纲领，推动湘鄂赣边区抗日民族统一战线的建立，做了许多工作。不久，延安八路军总部又派李涛、罗梓铭到平江嘉义，将湘鄂赣人民抗日红军游击队改编为新四军第一支队第1团，由傅秋涛任支队副司令员兼团长，张正坤任副团长。1938年初，张正坤随部队奔赴皖南抗日前线，调到第二团任团长。

这年5月，陈毅、粟裕率领新四军第一、二支队挺进苏南，开辟以茅山为中心的根据地，并决定消灭京沪线上新丰火车站的日本侵略军，作为给江南父老的见面礼。

新丰火车站位于镇江市东南郊，是日本侵略军的重要据点。张正坤接受了陈毅、粟裕交给的袭击火车站任务。当时，部队的装备十分低劣，既无重武器，又无攻坚器材。经过周密的调查研究，他令一、三营分别在车站两侧警戒上海、南京方向，自己率第二营担任主攻。深夜，他带领数十名战士，在机枪的掩护下，抵近敌人的炮楼，采用当年火烧玉皇殿的办法，指挥战士们用晒簟把炮楼紧紧围住，浇上几桶汽油，将几十名日军活活烧死在炮楼里，拔掉了这颗钉在京沪线上的钉子，大灭了日军的威风。陈毅司令员曾题诗称赞。

初战凯旋，士气大增。6月底，张正坤团又打了一个漂亮的伏击战。据侦察人员报告，日军将从金坛运输军用物资去丹阳。这天拂晓前，张正坤率部埋伏在金丹公路的一隘口处。上午8时许，从金坛方向开来三辆大卡车，有30多个日本兵押送。敌卡车刚进入火力圈，只见张正坤的枪一挥，就打破了第一辆军车的轮胎。顿时，公路两旁的枪声齐鸣，日军东逃西散。这次战斗除生俘日军四人外，还缴获了大量军用物资。由于新四军频繁活动，到处袭击敌人，日军龟缩到城里，不敢轻易下乡骚扰。

1940年，陈毅率苏南主力渡过长江，建立苏北指挥部。张正坤留在苏南坚持斗争。不久，江南新四军组编为三个新支队，张正坤任第三支队司令员兼参谋长，转战江南，浴血苦战。

1941年1月，蒋介石制造了震惊中外的皖南事变。当时，叶挺、项英率领新四军军部及江南三个支队共9000余人，在泾县的茂林地区遭国民党军队八万多人的包围。在危急关头，张正坤受命任第三纵队司令员，组织部队突围。他指挥部队同敌人激战了七个昼夜。由于敌众我寡，部队伤亡惨重。他的大腿又负了重伤，流血过多，战士们不得不将他抬下火线。途中，与敌军遭遇，他不幸被捕。

国民党顽固派将张正坤戴上脚镣手铐，转到江西上饶集中营，囚禁在七峰岩监狱。国民党派叛徒刘旦辉和娄子匡多次向他游说诱降，但都被张正坤严词斥退。他经常对难友说：“革命是要流血的，我们要坚持斗争，决不向敌人屈服!”有一次，看守给张正坤松掉脚镣手铐，要将他押到第三战区去。他宁死不从，乘其不备，一头撞在大树上，鲜血直流，敌人只好把他送回监狱。张正坤与难友冯达飞、郑龙泉等商定了越狱计划，在一个漆黑的夜晚，他向窗外扔了一块泥土，见外面无动静，撬开牢门。国民党军警发现有人越狱，追赶上来。张正坤与陈龙彪等三人为掩护难友脱险，朝另一个方向跑去，在皂头茅湾山上，他们被敌人追上，张正坤的腰部中了数弹，血涌如注，终于倒了下来…… （浏窗在线）